Зал во дворце Holy Rood. Вбегает паж королевы. Он рассказывает, что в городе беспорядки. Какой-то незнакомый ему человек во главе толпы — ряженых, в масках, танцоров с бубенцами, людей в чёрных капюшонах — грозил, предсказывал и призывал народ не подчиняться королеве. Придворный королевы Риччио подтверждает, что он тоже время от времени наблюдает, как народ жадно слушает эти проповеди. Паж рассказывает дальше, что народ ворвался в часовню королевы с криками: «Гнездо папистов!», что шут Дарнлея — мужа королевы — вскочил на алтарь и начал изображать проповедь, а народ отвечал ему издевательскими куплетами. Королева Мария Стюарт в отчаянии. Она чувствует ненависть народа, большинство придворных оставили ее; она недоумевает, как может её христианство так отличаться от христианства народа Шотландии. Риччио предлагает немедленно подготовить указ о наказании виновных в беспорядках. Мария диктует его пажу, паж уточняет, вписывать ли имя Генриха Дарнлея — мужа королевы. Мария колеблется; она подозревает, что беспорядки инспирированы именно им — ведь толпой предводительствовал шут короля. Тут Риччио напоминает ей, что это она королева; она как солнце, и право карать она имеет от Бога. Он требует немедленно вызвать дежурного офицера для оглашения указа королевы. Входит Дуглас. Мария велит ему отнести бумагу королевскому канцлеру Мортону, чтобы тот поставил печать. Дуглас просматривает указ и видит, что в нем нет имени короля. Он спрашивает об этом королеву. За неё отвечает Риччио. Дуглас теряет самообладание. Он призывает королеву не применять кровавых мер подавления, намекает, что видит в этом французское или итальянское влияние. Но королева холодно напоминает ему о своей власти устранять непокорных её воле подданных. Разражается ссора между Риччио и Дугласом, Дуглас вызывает Риччио на поединок и клянётся, что завтра убьёт венецианца. Королева удаляется и уводит Риччио. Дуглас остаётся один, он обдумывает поединок. Входит Мортон. Дуглас показывает ему указ. Мортон в нерешительности: он боится гнева и короля, и королевы. Не прикладывая печати, Мортон несёт указ королю. В это время Генрих занят разговором со своим шутом Ником, который поддразнивает его тем, что реальную власть в Шотландии имеет королева, а Генрих — только её муж, что королева выбирает себе приближённых, например, этого итальянского арфиста Риччио... В это время Мортон приносит злополучный указ. Король в гневе, он решает убить Риччио. Входит придворный короля Линдсей, он зовёт короля поохотиться с только что приобретённым соколом. Мортон отвечает, что сегодня у короля уже есть занятие. Линдсей охотно примыкает к заговору против Риччио. Входит Дуглас. Он буквально запрещает убивать Риччио сегодня вечером, потому что должен сам убить его завтра утром. Тогда Генрих, воспользовавшись отсрочкой, посылает шута к астрологу, чтобы узнать, каково расположение звёзд для его намерений.
Астролог в своей лаборатории (он одновременно и алхимик) рассуждает сам с собой о том, что опыт подтверждает тщету науки, что предназначение, воля звёзд властвуют над человеком, распоряжаются добром и злом. Входит шут Ник, сыплет остротами, астролог не уступает ему в острословии. Ник сообщает, что король послал его спросить о судьбе Риччио и подсказывает астрологу, чтобы он предсказал Риччио смерть. Астролог отвечает, что подсказывать ему будут звезды, а не люди, и в свою очередь предсказывает смерть шуту. С тем он и уходит. Появляется вызванный астрологом паж королевы. Паж обожает свою госпожу. Астролог велит ему передать королеве, что сегодня умрёт человек, которого она любит. «Как, Ботвел сегодня умрёт?» — восклицает паж. Астролог озадачен. Он имел в виду Риччио и торопит пажа, чтобы он предупредил об этом. Оставшись один, астролог задумывается — по звёздам тоже выходило, что Ботвел как-то мрачно связан с королевой — через Марс, Сатурн... Входит Ботвел. Из его монолога становится ясно, что он неожиданно для себя самого очутился в доме астролога. Поняв, куда он попал, Ботвел спрашивает у астролога, сколько ему осталось жить. Старик отвечает, что три года и что Ботвел будет королём. Ботвел вынимает флакон с ядом, с помощью которого он хотел покончить с собой, хочет его выбросить — и раздумывает. Ведь в атмосфере дворцовых интриг всякое оружие пригодится. Он уходит.
Паж сообщает королеве, что скоро придёт Риччио. Королева ждёт его с нетерпением — по её мнению, он один остался ей верен. «А Ботвел?» — спрашивает паж. «Кто это — Ботвел?» — интересуется королева. Удивлённый паж рассказывает Марии, как во время катания на лодках сильный ветер сорвал с головы королевы розу, цветок упал в воду. И тогда один из придворных — Ботвел — бросился в лодку и страшно погонял гребца, чтобы выловить розу из воды. Выслушав рассказ, Мария отсылает пажа, чтобы помолиться. Богу она признается, что нет у неё больше сил сопротивляться своей любви к Ботвелу. Королева знает, что при дворе её считают влюблённый в Риччио. Входит Риччио. Мария сообщает о грозящей ему смертельной опасности и холодно прощается с ним, указывая ему корабль, который отвезёт его в Рим. В отчаянии Риччио пытается умолить королеву отменить решение о его отъезде. Королева непреклонна.
Генрих, Мортон и Линдсей узнали о готовящемся отъезде Риччио и поспешно совещаются, убить его или дать ему отплыть. Тут появляется Дуглас и сообщает, что Риччио уже отплыл. Дуглас в отчаянии, он жаждет кровавой мести, его рыцарская честь задета. Внезапно они встречают пажа, который несёт королеве записку от Риччио — он не уехал и будет у неё вечером. Заговорщики отнимают записку.
Мария у себя в комнате занята вышиванием. Пришедший Риччио объясняет ей, что не мог уехать, поскольку у него поединок с Дугласом утром. Он признается, что жизнь без её любви ему не нужна. Он просит Марию отдать ему венок из роз — он поставит цветы на алтаре в Риме... Входят Генрих, Дуглас и Диндсей и убивают Риччио. Королева падает в обморок. Дуглас поражён стыдом и ужасом — он добровольно удаляется в изгнание. Генрих обеспокоен, не возненавидит ли его королева. Линдсей увлекает короля прочь, нашёптывая ему о предстоящей охоте. Входит приглашённый королевой Ботвел. Мария приходит в себя, видит Ботвела и признается ему в любви. Ботвел вынуждает её признать, что она хочет смерти Генриха и отдаёт ей свой флакон с ядом, сказав, что это снотворное. Мария передаёт королю это «лекарство», но яд выпивает шут. Однако уже ничто не может остановить убийственную интригу — Ботвел взрывает домик короля Генриха. В отдалении слышны нарастающие крики толпы. Ботвел с королевой скрываются.