Пасмурный осенний день. В саду, на аллее под старым тополем, сервирован для чая стол. У самовара — старая нянька Марина. «Кушай, батюшка», — предлагает она чаю доктору Астрову. «Что-то не хочется», — отвечает тот.
Появляется Телегин, обедневший помещик по прозвищу Вафля, живущий в имении на положении приживала: «Погода очаровательная, птички поют, живём мы все в мире и согласии — чего ещё нам?» Но как раз согласия-то и мира и нет в усадьбе. «Неблагополучно в этом доме», — дважды произнесёт Елена Андреевна, жена профессора Серебрякова, приехавшего в имение.
Эти отрывочные, внешне не адресованные друг другу реплики, вступают, перекликаясь, в диалогический спор и высвечивают смысл напряжённой драмы, переживаемой действующими лицами пьесы.
Заработался за десять лет, прожитых в уезде, Астров. «Ничего я не хочу, ничего мне не нужно, никого не люблю», — жалуется он няньке. Изменился, надломился Войницкий. Раньше он, управляя имением, не знал свободной минуты. А теперь? «Я <…> стал хуже, так как обленился, ничего не делаю и только ворчу, как старый хрен...»
Войницкий не скрывает своей зависти к профессору в отставке, особенно его успеху у женщин. Мать Войницкого, Мария Васильевна, просто обожает своего зятя, мужа её покойной дочери. Войницкий презирает учёные занятия Серебрякова: «Человек <…> читает и пишет об искусстве, ровно ничего не понимая в искусстве». Наконец, он ненавидит Серебрякова, хотя его ненависть может показаться весьма пристрастной: ведь он влюбился в его красавицу жену. И Елена Андреевна резонно выговаривает Войницкому: «Ненавидеть Александра не за что, он такой же, как все».
Тогда Войницкий выставляет более глубокие и, как ему представляется, неотразимые основания своего нетерпимого, непримиримого отношения к экс-профессору — он считает себя жестоко обманутым: «Я обожал этого профессора... я работал на него как вол... Я гордился им и его наукой, я жил и дышал им! Боже, а теперь? ...он ничто! Мыльный пузырь!»
Вокруг Серебрякова сгущается атмосфера нетерпимости, ненависти, вражды. Он раздражает Астрова, и даже жена с трудом его выносит. Все как-то прослушали высказанный диагноз болезни, поразившей и героев пьесы, да и всех их современников: «...мир погибает не от разбойников, не от пожаров, а от ненависти, вражды, от всех этих мелких дрязг». Они, включая и саму Елену Андреевну, как-то забыли, что Серебряков — «такой же, как все» и, как все, может рассчитывать на снисхождение, на милосердное к себе отношение, тем более что он страдает подагрой, мучается бессонницей, боится смерти. «Неужели же, — спрашивает он свою жену, — я не имею права на покойную старость, на внимание к себе людей?» Да, надо быть милосердным, твердит Соня, дочь Серебрякова от первого брака. Но услышит этот призыв и проявит к Серебрякову неподдельное, задушевное участие только старая нянька: «Что, батюшка? Больно? <…> Старые, что малые, хочется, чтобы пожалел кто, а старых-то никому не жалко. (Целует Серебрякова в плечо.) Пойдём, батюшка, в постель... Пойдём, светик... Я тебя липовым чаем напою, ножки твои согрею... Богу за тебя помолюсь...»
Но одна старая нянька не могла и не смогла, конечно, разрядить гнетущую, чреватую бедой атмосферу. Конфликтный узел так туго завязан, что происходит кульминационный взрыв. Серебряков собирает всех в гостиной, чтобы предложить для обсуждения придуманную им «меру»: малодоходное имение продать, вырученные деньги обратить в процентные бумаги, что позволило бы приобрести в Финляндии дачу.
Войницкий в негодовании: Серебряков позволяет себе распорядиться имением, которое фактически и юридически принадлежит Соне; он не подумал о судьбе Войницкого, который двадцать лет управлял имением, получая за то нищенские деньги; не задумался и о судьбе Марии Васильевны, столь беззаветно преданной профессору!
Возмущённый, взбешённый Войницкий стреляет в Серебрякова, стреляет дважды и оба раза промахивается.
Напуганный смертельной опасностью, лишь случайно его миновавшей, Серебряков решает вернуться в Харьков. Уезжает в своё небольшое именьице Астров, чтобы, как прежде, лечить мужиков, заниматься садом и лесным питомником. Затухают любовные интриги. Елене Андреевне не хватает смелости ответить на страстное увлечение ею Астрова. При расставании она, правда, признается, что увлеклась доктором, но «немножко». Она обнимает его «порывисто», но с оглядкой. А Соня окончательно убеждается, что её, такую некрасивую, Астров полюбить не сможет.
Жизнь в усадьбе возвращается на круги своя. «Опять заживём, как было, по-старому», — мечтает нянька. Без последствий остаётся и конфликт между Войницким и Серебряковым. «Ты будешь аккуратно получать то же, что и получал, — обнадёживает профессор Войницкого. — Все будет по-старому». И не успели отбыть Астров, Серебряковы, как Соня торопит Войницкого: «Ну, дядя Ваня, давай делать что-нибудь». Зажигается лампа, наполняется чернильница, Соня перелистывает конторскую книгу, дядя Ваня пишет один счёт, другой: «Второго февраля масла постного двадцать фунтов...» Нянька садится в кресло и вяжет, Мария Васильевна погружается в чтение очередной брошюры...
Казалось бы, сбылись ожидания старой няньки: все стало по-старому. Но пьеса так строится, что она постоянно — и в большом и в малом — обманывает ожидания и её героев, и читателей. Ждёшь, к примеру, музыки от Елены Андреевны, выпускницы консерватории («Мне хочется играть... Давно уже я не играла. Буду играть и плакать...»), а играет на гитаре Вафля... Действующие лица расставлены так, ход сюжетных событий принимает такое направление, диалоги и реплики спаяны такими смысловыми, часто подтекстовыми перекличками, что с авансцены оттесняется на периферию традиционный вопрос «Кто виноват?», уступая её вопросу «Что виновато?». Это Войницкому кажется, что его жизнь погубил Серебряков. Он надеется начать «новую жизнь». Но Астров рассеивает этот «возвышающий обман»: «Наше положение, твоё и моё, безнадежно. <…> Во всем уезде было только два порядочных, интеллигентных человека: я да ты. На какие-нибудь десять лет жизнь обывательская, жизнь презренная затянула нас; она своими гнилыми испарениями отравила нашу кровь, и мы стали такими же пошляками, как все».
В финале пьесы, правда, Войницкий и Соня мечтают о будущем, но от заключительного монолога Сони веет безысходной печалью и ощущением бесцельно прожитой жизни: «Мы, дядя Ваня, будем жить, <…> будем терпеливо сносить испытания, какие пошлёт нам судьба; <…> мы покорно умрём и там, за гробом, мы скажем, что мы страдали, что мы плакали, что нам было горько, и Бог сжалится над нами. <…> Мы услышим ангелов, мы увидим все небо в алмазах... Мы отдохнём! (Стучит сторож. Телегин тихо наигрывает; Мария Васильевна пишет на полях брошюры; Марина вяжет чулок.) Мы отдохнём! (Занавес медленно опускается.)»